Spessore ottimale della fetta per una migliore accuratezza dell'analisi quantitativa della distribuzione delle cellule fluorescenti e delle microsfere nella crioterapia

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 10907 (2023) Citare questo articolo

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La crioimaging è stata utilizzata efficacemente per studiare la biodistribuzione di cellule fluorescenti o microsfere in modelli animali. L'imaging fluorescente sequenziale fetta per fetta consente il rilevamento di cellule fluorescenti o microsfere per la corrispondente quantificazione della loro distribuzione nel tessuto. Tuttavia, se le sezioni sono troppo sottili, si verificheranno un sovraccarico di dati e tempi di scansione eccessivi. Se le fette sono troppo spesse, è possibile che manchino le cellule. In questo studio, abbiamo sviluppato un modello per il rilevamento di cellule fluorescenti o microsfere per facilitare la determinazione ottimale dello spessore della fetta. I fattori chiave includono: spessore della sezione (X), intensità delle cellule fluorescenti (Ifluo), coefficiente di attenuazione efficace del tessuto (μT) e soglia di rilevamento (T). Il modello suggerisce un valore ottimale dello spessore della sezione che fornisce una sensibilità quasi ideale riducendo al minimo il tempo di scansione. Il modello suggerisce inoltre un metodo di correzione per compensare le celle mancanti nel caso in cui i dati dell'immagine siano stati acquisiti con uno spessore della sezione eccessivamente ampio. Questo approccio consente agli operatori di crioimaging di utilizzare uno spessore della fetta maggiore per accelerare i tempi di scansione senza una perdita significativa del conteggio delle cellule. Abbiamo convalidato il modello utilizzando dati reali provenienti da due studi indipendenti: microsfere fluorescenti in un cuore di maiale e cellule staminali marcate con fluorescenza in un modello murino. I risultati mostrano che le relazioni tra spessore della sezione e sensibilità di rilevamento da simulazioni e dati reali erano ben abbinate con una correlazione del 99% e un errore quadratico medio (RMS) del 2%. Abbiamo anche discusso le caratteristiche di rilevamento in situazioni in cui i presupposti chiave del modello non sono stati soddisfatti, come la variazione dell'intensità della fluorescenza e la distribuzione spaziale. Infine, mostriamo che con impostazioni adeguate, il crio-imaging può fornire una quantificazione accurata della biodistribuzione delle cellule fluorescenti con rapporti di recupero notevolmente elevati (numero di rilevamenti/consegna). Poiché la tecnologia di crio-imaging è stata utilizzata in molte applicazioni biologiche, i nostri metodi ottimali di determinazione dello spessore delle fette e di correzione dei dati possono svolgere un ruolo cruciale nel migliorarne ulteriormente l'usabilità e l'affidabilità.

Il crioimaging è una tecnologia di imaging microscopico 3D che consente la localizzazione di cellule fluorescenti ovunque in un topo o ratto intero con sensibilità a singola cellula1,2,3,4,5,6,7,8,9. Il sistema è costituito da un criostato microtomo motorizzato, un microscopio con capacità di campo chiaro e fluorescente, un posizionatore robotico e un software di controllo. Per eseguire l'imaging criogenico, i tessuti di interesse vengono congelati istantaneamente utilizzando azoto liquido e fissati a una fase di sezionamento e viene impiegato sezionamento e imaging alternati. Il sistema acquisisce immagini piastrellate, con ampio campo visivo, ad alta risoluzione (~ 10 µm), in campo chiaro a colori e fluorescenti del tessuto. Impilando le sezioni di immagine, è possibile generare volumi di immagini 3D per la visualizzazione e l'analisi della biodistribuzione. Queste caratteristiche eccezionali rendono la crio-imaging unica rispetto ad altre modalità 3D in vivo come la risonanza magnetica (MRI) o l'imaging a bioluminescenza (BLI). Sebbene tali modalità di imaging in vivo possano fotografare un intero animale, mancano di una risoluzione adeguata e possono produrre solo immagini in scala di grigi. Con le caratteristiche sopra menzionate, la crioimaging colma una lacuna critica in altre modalità di imaging della ricerca biologica.

La crioimaging è stata utilizzata per studiare la biodistribuzione di cellule fluorescenti o microsfere in vari modelli animali, inclusi piccoli roditori2,3,4,6,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20, cani7,21, maiali5,22,23 e altri modelli animali24. Burden-Gulley et al.13,14,15 hanno utilizzato la crioimaging per visualizzare i comportamenti migratori e invasivi delle cellule di glioblastoma in un modello murino. Recentemente, abbiamo sviluppato una piattaforma basata sulla crioimaging per quantificare e valutare le metastasi fluorescenti in tutto il corpo del topo4,17,18,19. La piattaforma si è rivelata adatta per la valutazione e l'ottimizzazione di pipeline di tecnologie (agenti di imaging, metodi di imaging, terapie, modelli tumorali, ecc.) essenziali per rilevare, comprendere e trattare il cancro metastatico. Molti gruppi7,8,24,25 compreso il nostro5,26, hanno utilizzato la tecnologia per risolvere spazialmente la perfusione miocardica 3D quantitativa e ad alta risoluzione tramite il metodo di intrappolamento delle microsfere fluorescenti. Van Horssen all'el. hanno inoltre utilizzato la tecnologia per visualizzare la biodistribuzione sia delle microsfere fluorescenti7,21,22,23,27 che dei monociti marcati in modo fluorescente6 per studiare le proprietà della progressione della neovascolarizzazione coronarica nei cuori degli animali. Inoltre, abbiamo precedentemente utilizzato la tecnologia di crioimaging per studiare la biodistribuzione nell'intero corpo di cellule staminali iniettate per via endovenosa e di cellule immunitarie che inducono malattie in un modello murino di malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD)2,3,9,10,11,12 ,20,28,29. Esempi di immagini fluorescenti che mostrano i segnali delle microsfere e i segnali delle cellule staminali sono mostrati nel documento supplementare. Data l’elevata utilità della crio-imaging nella ricerca sull’imaging biomedico, ci sono state sempre più numerose applicazioni che utilizzano questa tecnologia.

100 µm) is often chosen. The benefits of a larger section thickness include faster imaging and computing times, less memory usage, and longer life for the sectioning knife. However, signals of dimly fluorescent cells embedded in a thick tissue may not reach the surface and may not be detected by the imaging system. The physics of signal loss can be described by the principles of light absorption and scattering in the biological tissue30,31,32,33. In general, by setting a slice thickness that is too large, a significant rate of false negatives can be expected. This would render the results unreliable, particularly in applications that demand accurate absolute quantification. On the other hand, if one sets the slice thickness to be too small, although accurate quantification can be obtained, it would not be computationally or economically efficient. For example, a tissue which can be imaged overnight (12 h) at 120 µm slice thickness will take 3 days (72 h) to scan at 20 µm. There is expected to be an optimal value for slice thickness that will give accurate cell/microsphere counting at a reasonable scan time./p>

20 µm, the number of detected cells will be less than the true number of cells in the tissue as shown in Fig. 3. This situation leads to false negatives. Next, we will propose a mathematical model of the relationship between the fluorescent cell detectability and the slice thickness especially in the sub-optimal range (X > Xoptimal)./p> Xoptimal), the number of detected cells decreases as the slice thickness increases. By formulating the mathematical relationship, one can predict the cell loss and even estimate a correction factor to compensate for the under-sampling. In this section, we aim to construct the relationship under some simplifications./p> Xoptimal (which implies e/X < 1.0), the number of observed cells (n) is reduced from the total cells in the sample (N) according to the relative distribution, d(x), of cells lying in a given slice. The distribution of cells is therefore also related to the probability of a cell being at a given distance, p(x). This can be formulated as/p> Xoptimal), the detection sensitivity decrease as the slice thickness increases. Also, remind that for all X values that are less than or equal to Xoptimal, the Sens value will be 100%. By combining X values from both ideal range (X ≤ Xoptimal) and sub-optimal range (X > Xoptimal), we obtain:/p> Xoptimal) would adversely affect the sensitivity. Three cell intensities were chosen for this simulation: Ifluo = 30, 50 and 80 (grayscale intensity). The numbers were chosen from the intensity distribution of cells derived from our stem cell imaging database. Parameters T and μT were set to 10 (gray level) and 314 cm−1, respectively. The detection threshold value (T) was empirically estimated based on the signal-to-noise-ratio (SNR) in our image data. The value of μT was estimated from mouse tissues in our database using an exponential fitting method proposed by Steyer et al.34. The programming platform used in this study was Matlab 2022a (MathWorks, USA)./p>

Xoptimal), the curve appeared as the reciprocal function derived in Eq. (14). By showing the relationship on a log–log scale, the relationship is shown to be perfectly linear (Fig. 6B), as predicted by the mathematical derivation described in Section “In silico simulations for non-compliant situations”./p> Xoptimal)./p> Xoptimal) (Fig. 10C,D)./p> Xoptimal). After running in silico simulations based on the assumptions, we made the following observations. When X ≤ Xoptimal, the Sens value was constant at 100%, but when X > Xoptimal, it decreased as a non-linear function of X (Fig. 6A). The relationship in the sub-optimal range was shown to be a reciprocal function of X Eq. (14). When plotted on a log–log scale, the relationship was linear with a slope of -1 (Fig. 6B). We speculate that this relationship would hold true for real data if the fluorescent cells behaved in a manner that was consistent with our key assumptions. Please note that we also developed a probabilistic model to predict the sensitivity profile in cases where the cell distribution is not uniform Eqs. (7)–(10) and with varying intensity Eqs. (16)–(17)./p> Xoptimal). In many applications, it is necessary for cryo-imaging users to choose a larger slice thickness in order to analyze a large piece of tissues such as pig hearts5,22,23,27, dog hearts7,21, or rabbit tissues24. As the sample volume is prohibitively large, a much larger slice thickness should be selected in order to efficiently optimize the imaging time, the memory space, and other costs. However, the larger the slice thickness beyond the Xoptimal value was, the higher the number of false negatives. In order to mitigate this issue, we propose that the relationship derived in Eqs. (14)–(15) can be used to estimate the true number of cells/microspheres. For example, if researchers conducted a microsphere biodistribution study in a large animal and needed to set a large slice thickness, say X = 100 μm while Xoptimal = 58 μm. By doing so, the cell signals acquired in their image data could be obtained with the sensitivity of only 58% (42% lost) as suggested by Eqs. (14)–(15). For correcting this, one may consider multiplying the number of found microspheres by a factor of 1/Sens (1/0.58 in our example) for estimating the true number of fluorescent microspheres in the tissue. This knowledge allows cryo-imaging operators to use larger slice thickness (much larger than Xoptimal) without significant loss of the microspheres. Such corrections could enable reduced scanning time of a large tissue such as a pig heart, going from days or weeks to hours or days. This finding makes that analyses feasible that may not previously be otherwise./p>

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